Из яичной скорлупы

Животные, обитающие на Земле в настоящее время, - это только малая часть всех живых существ, когда-либо населявших планету. В разных частях света палеонтологи находят останки древних организмов и с их помощью пытаются восстановить внешний вид и особенности жизнедеятельности динозавров, мамонтов, гигантских сумчатых хищников и других. Задача эта совсем не проста, так как ученым редко (а точнее - почти никогда не) попадаются целые скелеты. Обычно они довольствуются несколькими костями, клочком волос или парой зубов.

Надежда на то, что ситуация изменится и исследователи смогут получать информацию о доисторических существах не только путем утомительных попыток "превратить" кость в четырехметрового тираннозавра, появилась на рубеже XX и XXI веков, когда специалисты как следует освоили работу с ДНК. Длинные цепи дезоксирибонуклеиновых кислот содержатся в каждой клетке организма и несут о нем самую исчерпывающую информацию.

В последние годы ученые сумели получить ДНК из ископаемых останков нескольких видов живых существ. К наиболее громким успехам можно причислить выделение ДНК мамонта и неандертальца. Однако несмотря на всю перспективность метода, подобных работ пока не очень много. Дело в том, что ДНК очень плохо сохраняется в образцах. Мягкие ткани животных быстро гниют, причем нередко бактерии (именно бактерии отвечают за процессы гниения) "съедают" их дочиста. Поэтому в качестве потенциальных источников ДНК ученые могут использовать только твердые останки, например кости или волосы.

Но и здесь исследователи сталкиваются с серьезными трудностями. Кости являются излюбленным местом обитания бактерий. Микроорганизмы не всегда справляются с задачей уничтожения каркаса из карбоната кальция, но уж всю органическую "начинку" они вычищают с успехом. В 2006 году группа исследователей показала, что только 45 процентов ДНК мамонта, полученной из его костей, похожа на ДНК современных слонов. Остальные 55 процентов гораздо больше напоминают геномы разнообразных бактерий. С волосами ситуация несколько лучше (от 58 до 90 процентов ДНК из волос оказалась похожа на ДНК слона), но обнаружить их палеонтологам удается еще реже, чем кости.

Новая надежда

Группа исследователей под руководством Майкла Бьюнса (Michael Bunce) из университета Мердока в Австралии решила попробовать еще один потенциальный источник ДНК - яичную скорлупу. Она имеет весьма сложное строение, и под твердой наружной оболочкой из карбоната кальция находится еще несколько слоев, хорошо защищенных от внешних воздействий. Авторы предположили, что эти органические слои хранят ДНК. Ее источником могут служить, например, клетки мембранной оболочки, окружающей эмбрион, которые случайно "осели" на скорлупе.

Остатки яиц гигантских вымерших птиц и даже динозавров ученые находят относительно часто, однако до настоящего момента никто не пытался выделять из яичной скорлупы ДНК. Несколько подобных работ были выполнены на яйцах ныне живущих птиц, и их результаты были весьма обнадеживающими.

В качестве объекта исследования Бьюнс и коллеги выбрали огромных птиц, обитавших в Австралии, Новой Зеландии и на Мадагаскаре и истребленных человеком. Исследователи собрали скорлупу яиц моа, рост которых мог достигать 3,6 метра, и эму - их рост доходил до 1,9 метра. Кроме того, ученые нашли скорлупу слоновых птиц (относятся к семейству эпиорнисовых), которые достигали в высоту 3 метров и яйца которых по объему превосходят куриные в 160 раз. Ученые собирали скорлупу различной толщины, хранившуюся в разных климатических условиях. Возраст образцов колебался от 400 до 50 тысяч лет.

Прежде чем разрабатывать технологию выделения ДНК из скорлупы, авторы решили посмотреть, где именно концентрируется ДНК. Бьюнс и коллеги обработали фрагменты скорлупы специальным красителем, который встраивается между соседними нуклеотидами (элементарными составляющими ДНК), а затем изучили образцы под микроскопом. Ученые ожидали, что большая часть нуклеиновых кислот будет сосредоточена во внутренних слоях (так как они непосредственно прилегают к мембранным оболочкам), однако на деле оказалось, что ДНК равномерно распределена по всей толщине скорлупы. Нуклеиновые кислоты были сосредоточены в небольших "горячих зонах", видимых под микроскопом как светящиеся области.

Равномерное содержание ДНК во всех слоях позволяло использовать для экстракции всю скорлупу целиком. Для надежности авторы удалили верхний наружный слой, который был загрязнен больше остальных. На следующем этапе возник вопрос, по какой методике экстрагировать ДНК, ведь до сих пор никто не работал с ископаемой скорлупой. Бьюнс и соавторы решили модифицировать технологию, применяемую для выделения ДНК из костей. В ходе этой процедуры специалисты экстрагируют большую часть карбоната кальция и выбрасывают его. Для того чтобы получить ДНК из скорлупы, ученые решили сохранить эту фракцию. Анализ показал, что именно в ней содержится большая часть ДНК. Исследователи предположили, что в плотном матриксе из карбоната кальция нуклеиновые кислоты оказываются защищены от неблагоприятных внешних воздействий и поэтому сохраняются лучше всего.

Бьюнс и коллеги испробовали несколько схем экстракции ДНК и в конце концов смогли добиться значительного выхода практически для всех образцов. В ходе работы ученые выяснили, что в яйцах с тонкой скорлупой ДНК сохранялась так же хорошо, как в толстостенных. Исследователи не смогли получить ДНК только из скорлупы возрастом 50 тысяч лет, принадлежащей двухметровой вымершей птице из рода Genyornis. Таким образом, самому старому образцу, из которого удалось получить ДНК, стукнуло "всего" 19 тысяч лет. Полученную ДНК исследователи сравнили с немногими последовательностями, имеющимися в генетических базах данных (они были выделены из других источников). Проверка подтвердила, что специалисты получили ДНК ископаемых птиц, а не бактерий или грибков, заразивших образцы.

Во всех случаях ученые смогли выделить два типа ДНК: митохондриальную и ядерную. Первый тип содержится в клеточных органеллах митохондриях - миниатюрных энергостанциях, производящих "топливо" для работы клетки. Митохондриальная ДНК в сотни тысяч раз короче ядерной, и поэтому она намного лучше сохраняется в палеонтологических образцах. Но по сравнению с нуклеиновыми кислотами, хранящимися в ядре, короткие молекулы митохондриальной ДНК несут ничтожно мало информации об организме. Поэтому основной задачей исследователей является получение именно ядерной ДНК.

Ядерную ДНК ранее удавалось выделять и из костей, однако полученные исследователями образцы были очень грязными и содержали огромное количество микробных примесей. Бьюнс с коллегами сравнили чистоту ДНК из скорлупы с ДНК из костей. Оказалось, что "яичные" нуклеиновые кислоты в разы чище "костяных".

Не просто так

По мнению исследователей, высокая сохранность ДНК объясняется тем, что скорлупа была специально создана природой так, чтобы максимально защищать содержимое яйца от агрессивной среды, в том числе и от проникновения микробов.

Результаты новой работы выглядят очень перспективными. Авторам удалось найти богатый источник ДНК высокой степени сохранности и чистоты. Пока ученые не пытались расшифровать полногеномные последовательности ДНК гигантских птиц, но так как с секвенированием (термин, использующийся для обозначения расшифровки полногеномных последовательностей) небольших фрагментов проблем не было, можно предположить, что и большие куски удастся расшифровать без особых трудностей. Тем более что эффективность современных технологий секвенирования стала фантастической. Если выводы Бьюнса и коллег подтвердятся, то исследователи получат уникальный инструмент для получения ДНК живых существ, откладывающих яйца. Имея ДНК, ученые смогут узнать о наших планетарных предшественниках практически все.